复制压力导致的复制叉停滞会引起细胞死亡或癌变等严重后果。复制叉发生翻转形成“鸡爪结构”是真核生物应对复制压力的重要方式。该项目首次提出了“鸡爪结构”通过两步级联反应形成的新模型。

Replication stress could cause fork pausing, which subsequently results in cell death or cancer. Replication fork reversal is global response to replication stress and involves the conversion of a typical replication fork from a three-way junction into a four-way chicken-foot like structure. For the first time, this project reveals that fork reversal occurs via a sequential two-step mechanism.

项目负责人黄俊教授是浙江大学求是特聘教授、生命科学研究院资深研究员、博士生导师。主要以范可尼贫血症、布鲁姆综合症及遗传性乳腺癌等疾病为模型，研究DNA损伤修复及肿瘤发生发展的分子机制，相关研究成果分别以通讯或共同通讯作者发表于Science、Molecular Cell、Nature Communications、PNAS、The Journal of Cell Biology、Current Biology、EMBO Reports等杂志。先后主持国家自然科学基金委重点项目、重点国际合作项目、国家重点研发计划、霍英东青年教师基金等项目；获得国家杰出青年科学基金、国家“万人计划”科技创新领军人才、国家“万人计划”青年拔尖人才、国务院政府特殊津贴专家、浙江省特聘专家、浙江省杰出青年科学基金等人才项目资助和荣誉；2017年还以第一完成人获得浙江省自然科学一等奖。

图1 复制叉翻转时“鸡爪结构”的形成

图2 复制压力下“鸡爪结构”形成的新机制

DNA的精确复制对于维持基因组稳定性至关重要。然而复制叉时常会遭受来自细胞内外的复制压力而停滞，如果无法及时重新起始，将造成复制叉崩塌，影响基因组稳定性甚至导致细胞死亡。1976年Higgins N. Patrick等人在研究复制相关的损伤修复时，在哺乳动物细胞中观察到了一种Holliday Junction的结构。他们猜测该结构形成的原因是复制叉停滞后，两条新合成的DNA子链与亲代DNA链解开后发生退火而翻转，进而将正常的复制叉结构重塑成Holliday Junction结构（图1），该过程也被称为复制叉翻转。由于Holliday Junction结构的形状与鸡爪相似，生物化学教科书中也通常将其称为“鸡爪结构 (chicken foot)”。受检测技术的限制，直到2002年José M. Sogo等人才在检验点缺陷的酵母细胞中观察到“鸡爪结构”，“鸡爪结构”也因此被认为是复制失败的副产物，其生理意义一直存在争议。近年来研究表明，在高等真核生物细胞中，复制叉翻转是由PARP1介导的应对复制压力的关键调控机制，酵母中由于缺乏PARP基因，因而在正常生理条件下极少能够观察到“鸡爪结构”的存在。

黄俊实验室在电镜下观察“鸡爪结构”时，注意到翻转的第四条链的长度可以达到数千碱基对。显而易见的是，在复制叉翻转过程中，新合成的链与亲代DNA链解开将会在位于复制叉后方新合成的DNA双链上产生拓扑张力，进而抑制复制叉的进一步翻转。因此他们猜测复制叉在翻转过程中需要通过拓扑异构酶释放拓扑张力，促进复制叉的深度翻转（图2）。他们通过EM (Electron Microscope)、single-molecular DNA fiber、iPOND (isolation of proteins on nascent DNA)、PLA (Proximity Ligation Assay)等实验手段发现拓扑异构酶TOP2A正是释放复制叉翻转过程中产生的拓扑张力的关键因子。TOP2A通过感应拓扑张力进而被募集到停滞的复制叉处，在释放拓扑张力的同时招募SUMO化修饰的E3连接酶ZATT对自身进行SUMO化修饰，进而招募下游SUMO靶向的转位酶PICH对复制叉进行进一步翻转。

该研究首次提出了“鸡爪结构”是通过两步级联反应而形成的新模型（图2）。第一步，在复制叉遭遇复制压力时，复制叉发生停滞，由转位酶HLTF、ZRANB3、SMARCAL1等蛋白催化复制叉的初始翻转，同时在复制叉后方新合成的DNA双链上产生拓扑张力；第二步，拓扑异构酶TOP2A释放拓扑张力，并通过SUMO化修饰招募转位酶PICH促进复制叉的深度翻转。进一步的功能研究表明，复制叉的深度翻转对于复制压力下维持基因组稳定性至关重要。