本研究通过建立完善的细胞器超纯化体系，系统绘制和解析了高维度、多层级、跨区域时空动态调控细胞活动图谱及新机制、新范式，拓展了在癌症生物学过程中新视觉。

In this application, through the establishment of a complete organelle-related affinity purification system, we systematically mapped the lncRNAs enriched in various organelles and precisely explored the novel mechanism and paradigm of this organelle-enriched lncRNAs in dynamically regulating multiple cellular processes including signaling, which expanded the novel insight of lncRNAs in cancer biology.

细胞器长链非编码RNA图谱绘制及功能解析

图1

图2

一、科普讲解：生命“暗物质”有了“星空图”

2003年人类基因组计划便绘制了人类基因组图谱，然而诸多人类疾病的基因联系仍未明晰，这为人类“基因组字典”留下了研究空白。近年研究揭示人类基因组80%以上的转录产物并不编码蛋白，为非编码RNA，其功能大量未知，堪称生命“暗物质”。其中长链非编码RNA（LncRNA）是数量最多的类型。

坚信“天生我材必有用”，我们对非编码RNA组成的“无字天书”充满了兴趣。经过一系列努力，我们前期成功鉴定并命名了肿瘤发生相关LncRNA CamK-A，为肿瘤诊治提供了潜在新靶标 (Sang et al. Molecular Cell, 2018)。这一发现使我们相信对该“无字天书”的破译或将是对生命科学理论的重要补充，值得深入研究。

细胞内区室化是真核细胞的基本特征之一，核酸等生物分子通过区室化分布介导各细胞器的结构与功能。我们从LncRNA亚细胞空间定位与功能的角度入手，经过一系列摸索，创建了细胞器免疫亲和分离纯化技术体系，突破了常规细胞器分离技术分辨率瓶颈，结合RNA组学、生物信息学分析，成功绘制了人类细胞器LncRNA图谱，并通过细胞、生化实验发现这些LncRNA能够介导细胞器结构组成及代谢功能调控。进一步，我们从中揭示了一个细胞能量“发电厂”线粒体细胞器定位的LncRNA GAS5通过充当细胞“低电量模式”分子开关，介导能源匮乏条件下线粒体“功率”限制，维持细胞代谢稳态。GAS5在肿瘤组织中异常下调，满足肿瘤恶性进展。该特性赋予了GAS5作为肿瘤诊断标志物的转化潜力（图1）。

该研究为生物理论、人类疾病研究提供了崭新视角，并已于2021年1月以封面论文刊发在细胞代谢顶级期刊Nature Metabolism上。

二、新闻报道：Cell Research | 林爱福团队报道LncRNA通过液-液相分离机制调控Hippo信号活化

细胞内蛋白质、核酸等生物大分子可通过液-液相分离（LLPS）形成液滴样无膜结构，为各种生命活动提供区室化反应空间，提高各种生化反应效率[1]。LLPS受多价弱相互作用驱动，这类作用力来自于蛋白内在无序区（IDR）/类朊病毒病序列（PrLD）、支架DNA或RNA分子。长链非编码RNA（Long non-coding RNA, LncRNA）可作为支架分子促进和维持无膜结构的形成，对基因转录等重要生物学事件发挥调控作用，如应激时神经元细胞中LncRNA NEAT1可与TDP-43共定位并促进TDP-43蛋白的相分离，使TDP-43在细胞应激时在细胞核内形成具有细胞保护功能的无膜、液滴状、动态可逆的核颗粒[2]。

目前研究证明LncRNA在细胞信号调控中发挥重要调控功能。浙江大学林爱福等课题组在内的一系列前期研究，发现细胞膜脂结合LINK-A促进了细胞质膜PIP3-AKT信号转导[3]，细胞质CamK-A介导了Ca2+信号与NF-κB信号交互[4]，细胞核BCAR4介导了Hedgehoge-Hippo信号转录协同[5]，此外，林爱福团队近期在Nature Metabolism发表论文，通过建立细胞器免疫亲和纯化体系，绘制了细胞器LncRNA图谱，并从中揭示了线粒体LncRNA GAS5介导三羧酸循环代谢区室解离中的重要调控作用（详见BioArt报道：专家点评Nat Metab | 林爱福组建立细胞器非编码RNA图谱并解析其功能）[6]。深入阐明细胞质LncRNAs调控细胞信号转导的作用方式和机理机制，将丰富人们对细胞信号转导的认知，为揭示肿瘤等恶性疾病发生提供理论指导和临床借鉴。

2021年7月15日，浙江大学生命科学学院林爱福课题组在Cell Research杂志在线发表题为 A Phosphatidic Acid-binding LncRNA SNHG9 Facilitates LATS1 Liquid-liquid Phase Separation to Promote Oncogenic YAP Signaling 的研究论文。该研究发现磷脂酸结合型LncRNA SNHG9通过调控Hippo信号节点激酶LATS1相分离，继而调控YAP肿瘤信号活化和肿瘤发生发展。该文阐明了细胞质LncRNA通过介导节点激酶分子相分离以调控细胞信号转导的新机制，为肿瘤诊治提供理论依据和潜在靶标。

该研究通过转录组测序和生信分析，发现了一系列在乳腺癌中高表达的LncRNAs，其中SNHG9（small nucleolar RNA host gene 9）表达显著上调，提示SNHG9可能参与乳腺癌的恶性进展。通过RNA pulldown和Lipid dot blot等实验发现，SNHG9可与磷脂酸（Phosphatidic acid，PA）和Hippo节点激酶LATS1直接结合, PA结合SNHG9可进一步抑制LATS1-MOB1复合体的形成，继而下调LATS1激酶活性和YAP磷酸化水平，从而促进YAP靶基因的转录和乳腺癌细胞增殖。

在借助免疫荧光观察SNHG9过表达细胞系中LATS1蛋白亚细胞定位时，研究人员发现与蛋白发生相分离形成的斑点类似，LATS1蛋白在细胞质中形成液滴状的的亮斑，提示LATS1在该条件下可能发生了液-液相分离。通过生物信息学分析LATS1蛋白的氨基酸序列，发现LAST1的N端含有PrLD序列，进一步支持了LATS1可能发生液-液相分离的猜想。研究人员截取已报道的可发生相分离蛋白的内部无序区（IDR），置换到LATS1的PrLD序列，发现截去PrLD的LATS1不能发生相分离，而置换其它蛋白IDR恢复了LATS1蛋白的相分离能力，证实PrLD序列介导了LATS1蛋白发生相分离。以此为突破口，研究人员通过一系列分子生化实验，证实SNHG9可通过促进LATS1相分离来抑制LATS1的激酶活性。

综上，该研究提出了SNHG9参与Hippo信号转导的工作模型：PA结合的SNHG9与LATS1形成复合物，阻止MOB1和LATS1互作、抑制LATS1的激酶活性；另一方面，LATS1蛋白的PrLD序列可驱动LATS1相分离的发生，SNHG9则作为支架招募LATS1蛋白聚集并提高LATS1蛋白的局部浓度、促进LATS1相分离的发生并抑制其激酶活性，从而促进YAP的入核和转录活性（图2）。该研究揭示了SNHG9-LATS1-PA通过液-液相分离机制调控Hippo信号通路和乳腺癌的发生发展，有助于更好地理解液-液相分离参与信号转导和疾病发生发展的作用和机制，并为癌症等人类重大疾病诊治提供了新靶标。 

参考文献：

1. Alberti, S., Gladfelter, A., and Mittag, T. (2019). Considerations and Challenges in Studying Liquid-Liquid Phase Separation and Biomolecular Condensates. Cell 176, 419-434.

2. Wang, C., Duan, Y., Duan, G., Wang, Q., Zhang, K., Deng, X., Qian, B., Gu, J., Ma, Z., Zhang, S., et al. (2020). Stress Induces Dynamic, Cytotoxicity-Antagonizing TDP-43 Nuclear Bodies via Paraspeckle LncRNA NEAT1-Mediated Liquid-Liquid Phase Separation. Mol Cell 79, 443-458 e447.

3. Lin, A., Hu, Q., Li, C., Xing, Z., Ma, G., Wang, C., Li, J., Ye, Y., Yao, J., Liang, K., et al. (2017). The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nat Cell Biol 19, 238-251.

4. Sang, L.J., Ju, H.Q., Liu, G.P., Tian, T., Ma, G.L., Lu, Y.X., Liu, Z.X., Pan, R.L., Li, R.H., Piao, H.L., et al. (2018). LncRNA CamK-A Regulates Ca(2+)-Signaling-Mediated Tumor Microenvironment Remodeling. Mol Cell 72, 71-83 e77.

5. Zheng, X., Han, H., Liu, G.P., Ma, Y.X., Pan, R.L., Sang, L.J., Li, R.H., Yang, L.J., Marks, J.R., Wang, W., et al. (2017). LncRNA wires up Hippo and Hedgehog signaling to reprogramme glucose metabolism. EMBO J 36, 3325-3335.