团队合照

图1. 时空孤立的随机单分子电致化学发光信号

图2. 单分子电致化学发光显微镜在微纳结构成像上对超分辨成像的论证

图3. 单分子电致化学发光显微镜活细胞成像

图4. 自然杂志第 596 卷第 7871 期封面

教科书上的化学反应都是以单分子形式进行概念描述，但传统实验中得到却是大量分子的平均结果。单分子实验是从本质出发解决许多基础科学问题的重要途径之一，是研究方法的质变。这也是化学测量学面临的一个极限挑战。

化学反应过程中，为什么难以开展单分子信号的捕捉呢？这主要是因为单分子反应控制难、追踪难、检测难。单分子化学反应伴随的光、电、磁信号变化非常微弱，而且化学反应过程和位置具有随机性，很难控制和追踪。

试想，如果您想欣赏银河的壮丽景观，就应该选择一个没有月亮的夜晚，远离城市的光污染，这样才能尽可能多的看到发光很暗的天体。完全相同的原理适用于观测尺度的另一端----显微成像：在完全黑暗中观察微弱的信号要容易得多。因此，人们是否可以通过在全暗条件下排除外界噪声的干扰，实现对单分子尺度化学反应信号的探测？

电致化学发光是利用电极表面发生的一系列化学反应实现发光的形式。相比于传统的荧光成像技术，由于不需要光激发，电致化学发光几乎没有背景，因而是理想的“全暗”条件。电致化学发光是目前对于灵敏度有着很高要求的体外免疫诊断领域的重要手段，每年大约有20亿次临床免疫诊断应用，其在成像分析等方向也具有一定价值。目前，电致化学发光存在两个重要的科学问题，其一是微弱乃至单分子水平电致化学发光信号的测量和成像，这对于单分子检测非常重要。其二是在电致化学发光成像领域实现突破光学衍射极限的超高时空分辨率成像，即超分辨电致化学发光成像，这一点对化学和生物成像具有重要意义。

顾名思义，电致化学发光的过程通常伴随着光子的释放，而当尺度到达单分子水平时，每个分子在发生化学反应后最多只能释放出一个光子。结合电化学发光自身的“全暗”特性，通过控制溶液中的分子浓度和采样速度，使得在空间上分子处于孤立的单分子水平，时间上让分子在该尺度下只能发生一次化学反应。最终能够在信噪比大于5的水平上实现对单个光子的单次化学反应释放的信号实现探测。因而从原理上证明了电致化学发光实现单分子检测的可能性。
光学显微镜的分辨率通常受到光学衍射极限的限制而无法突破200 nm。所谓超分辨显微镜，即是分辨率超越衍射极限限制的显微成像技术，该技术获得了2014年度诺贝尔化学奖，而现有的基于电致化学发光成像的技术还未能实现超分辨成像。项目探测到的单分子化学反应释放出的光子具有亮暗随机孤立的特性。这就好比当人们夜晚抬头看星星时，可以通过星星的“闪烁”将离得很近的两颗星星区分开一样。由于单分子化学反应的随机性，通过空间上的发光位置定位，再把每一帧孤立分子反应位置信息叠加起来，构建出化学反应位点的“星图”即实现超分辨成像。

为验证这一成像方法的可行性以及定位算法的准确性，研究团队通过精密加工的方法，在电极表面人工制造了一个微纳结构条纹图案作为已知成像模板，并进行对比成像，条纹间隔为几百个纳米。该微纳结构的单分子电致化学发光成像与电镜成像结果高度吻合。而且，单分子电致化学发光成像将传统上数百纳米的电致化学发光显微成像空间分辨率提升到了前所未有的22纳米。

该技术应用于生物细胞显微成像时，可以不需要标记细胞结构本身，意味着电致化学发光成像对细胞可能是潜在友好的，因为传统使用的标记可能会影响细胞状态。团队进一步以细胞的基质黏附为对象，对其进行单分子电致化学发光成像，观察其随时间的动态变化。成像结果与荧光超分辨成像可以进行关联成像对比，定量上表现出可以同荧光超分辨显微镜相媲美的空间分辨率，同时该技术避免了激光和细胞标记的使用。

该工作作为封面文章刊载于2021年8月11日出版的《自然》期刊，在同一期上，《自然》期刊专门邀请了领域专家对这一突破性技术的前景进行了亮点评述和报道，领域专家Frederic Kanoufi和Neso Sojic教授评论：“该工作提出了基于化学过程实现超分辨显微成像的新概念”。未来，这项显微技术将作为一项研究工具为化学反应位点可视化、单分子测量、化学和生物成像等领域提供新的可能，具备广泛的应用前景。