荧光RNA适配体是一类有前景的RNA分子荧光标记工具。本项目通过对新型荧光RNA适配体Pepper的高级结构研究，阐释了RNA分子对染料HBC的特异性识别和荧光激活机制，为其在细胞内的应用提供了必要的实验基础和理论依据。

Fluorogenic RNA aptamer is one promising RNA labelling tool. In this project, we focused on the tertiary structure research of the newly developed fluorogenic RNA aptamer, Pepper in complex with the dye HBC. Base on the structural results, we illustrated the specific recognition pattern of Pepper and the fluorescence activation mechanisms, which provide the thorough basis for application of Pepper/HBC in vivo and in vitro.

项目负责人任艾明博士，2010年在中科院上海有机所获得博士学位，随后在美国斯隆凯瑟琳癌症研究中心Dinshaw Patel教授课题组进行博士后研究。2016年入职浙江大学生命科学研究院任研究员；随后作为独立研究员，带领团队针对能够独立发挥功能的重要RNA分子高级结构和作用机制进行研究，2020年获得了国家自然科学基金委优秀青年项目的支持。

项目研究团队目前主要由浙江大学的在读博士研究生组成，研究成果也主要由博士研究生完成。团队先后在国际著名学术期刊如NatureChemicalBiology，Nature Communications, PNAS及Nucleic Acids Research等发表以浙江大学为第一单位的高水平论文9篇。本项目虽然为合作项目，但主要由项目研究团队主导和完成，对方团队进行补充和协作。

团队照片

图1. 荧光RNA适配体

图2. Pepper-HBC复合物结构

细胞里生物大分子机器复杂而精巧，它们在生命活动过程如何运转一直是人类不断探索的神秘领域。荧光蛋白（例如绿色荧光蛋白GFP）标签的发现和发展推进了人们对蛋白质机器的认知。在生物体“黑洞”非编码RNA分子机器研究上，RNA分子在转录、翻译、转运、剪切、定位、降解等动态过程如何运转，同样需要如荧光蛋白一样有力的标签实现有效的定位追踪。荧光RNA适配体是近年来发展的一种简单而有效的RNA分子荧光标记工具，可以通过结合并固定在溶液中不发荧光的染料小分子产生强烈的荧光，进而担当荧光蛋白在蛋白成像中的作用，被应用于RNA分子研究及活细胞成像（图1）。

已有的RNA荧光适配体主要包括Spinach、Mango、Broccoli和Corn等适配体，但其中绝大多数RNA荧光适配体都包含G-四联体，而G-四联体结构会在一定程度上限制适配体在体内发挥功能。此外，细胞中的G-四联体特异性解旋酶，如DHX36，还可能会识别并破坏G-四联体的结构。DIR2s是唯一不具有G-四联体的荧光RNA适配体。但是DIR2s 倾向于形成二聚体形式，这可能会干扰其标记的RNA在活细胞中的各种代谢过程。为此，我们需要发展更多种类的RNA荧光适配体实现活细胞RNA特异性标记和成像。

HBC（（4-（（2-羟乙基）（甲基）氨基）-亚苄基）-氰基苯乙腈）是基于绿色荧光蛋白GFP的荧光团HBI（4-羟基亚苄基咪唑啉酮）开发的一种新型染料配体（图2A）。Pepper适配体是通过SELEX（指数富集的配体系统进化）技术体外筛选得到的可以特异地结合并激活HBC产生荧光的RNA分子，其二级结构如图2B所示。

Pepper适配体是如何特异性识别HBC并激发其产生荧光的呢？为了阐明Pepper适配体识别配体HBC和荧光激发的机制，项目组团队解析了Pepper-HBC复合物的晶体结构。与绝大多数已有的RNA荧光适配体不同，它的三级结构中不包含G-四联体，采用了一种全新的RNA折叠构象（图2-C, D）。从整体形状上看，Pepper-HBC复合物呈音叉状，包括三个双螺旋（P1、P2、P3）和三个连接区域（J1/2, J2/1, J3/2）。在结构当中，连接处J3/2 和J1/2 与双螺旋P2形成远距离的相互作用，有助于三维结构的稳定（图2C）。配体HBC结合于整体结构的中心位置（图2D），以近平面构象堆积于四个碱基形成的平面（U8, G41, U42, C43）和G10-U40非经典碱基对之间（图3-E, F），并由碱基对G9-C33对从侧面帮助固定（图2-D, E）。另外，复合物结构中存在若干镁离子，它们的作用就像铆钉一样，帮助维持整体结构的稳定以及配体结合口袋的形成。结合体外体内荧光实验结果，我们验证了关键核苷酸对Pepper适配体结合染料配体HBC的重要性以及其他离子对Pepper适配体结合并激活HBC荧光的影响。此外，我们还解析了Pepper适配体与六种HBC类似物的复合物晶体结构，整体结构均与Pepper-HBC复合物类似，通过对配体结合口袋系统而细致的比较，我们深入揭示了Pepper适配体与配体之间的结合机制。

基于获得的三维结构信息和相关体内体外突变实验，我们阐明了RNA荧光适配体Pepper如何在金属离子的帮助下通过折叠形成复杂的三维结构；在整体三维结构基础上形成的具有特定形状的口袋，可以通过分子间相互作用将染料配体HBC精准地“捕获”并固定在口袋当中；染料分子通过与RNA三维结构的作用，构象得以固定，荧光得到大幅度增强；随后，我们进一步优化了Pepper适配体的核苷酸序列并对染料分子本身进行了设计和改造。这些结果为Pepper荧光适配体的应用提供了坚实的实验基础和理论依据，也为继续探索细胞里关于RNA分子的奥秘提供了方便有效的工具。